nidНефрология и диализNephrology and Dialysis1680-44222618-9801Российское диализное общество10.28996/2618-9801-2021-2-219-224nid-32Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESИзучение цитотоксического действия уремического токсина индоксилсульфата на миобласты in vitro, экспрессию мРНК миостатина в культуре клеток миобластов и возможности экзогенной регуляцииA study of cytotoxic effect of the uremic toxin indoxyl sulfate on myoblasts in vitro, the expression of myostatin mRNA in myoblast cell culture, and the possibility of exogenous regulationФуралевВ. А.FuralyovV. A.noemail@neicon.ruКукесВ. Г.KukesV. G.noemail@neicon.ruГаздановаА. А.GazdanovaA. A.al.gazdanova@gmail.comФедеральное государственное учреждение Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наукРоссияFederal research center "Fundamentals of biotechnology" of the Russian Academy of sciencesRussian FederationФедеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской ФедерацииРоссияSechenov First Moscow State Medical UniversityRussian Federation202121062024232219224Copyright © Фуралев В.А., Кукес В.Г., Газданова А.А., 20242024Фуралев В.А., Кукес В.Г., Газданова А.А.Furalyov V.A., Kukes V.G., Gazdanova A.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.nephro.ru/jour/article/view/32

Обоснование: индоксилсульфат - уремический токсин, рассматриваемый как один из источников развития мышечной слабости (кахексии) у пациентов с почечной недостаточностью, ухудшающей прогноз жизни данной категории пациентов. Цель исследования: изучение возможности экзогенной регуляции токсического влияния индоксилсульфата на миобласты in vitro. Материал и методы: культуру первичных миобластов мыши получали по стандартной методике. Клетки культивировали в среде DMEM с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (FST) (Gibco) при 37 °C и 6% CO2. Изучение влияния индоксилсульфата на скорость пролиферации миобластов проводили путём измерения скорости восстановления бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия (МТТ, Sigma). Для измерения экспрессии миостатина РНК из миобластов мыши выделялась с помощью реагента Trizol («Thermo Fisher Scientific»). Обратная транскрипция проводилась с помощью набора реагентов фирмы «Силекс». Для сравнения экспрессии миостатиновой мРНК в миобластах применялся метод полимеразной цепной реакции в реальном времени. Амплификация проводилась в следующем режиме: активация HotTaq-полимеразы - 95 °С, 5 мин; денатурация - 95 °С, 15 с; отжиг и элонгация - 60 °С, 1 мин; 40 циклов. Использовались следующие праймеры: миостатин прямой 5`-CAGCCTGAATCCAACTTAGG-3`, миостатин обратный 5`-TCGCAGTCAAGCCCAAAGTC-3`, ГАФД прямой 5'-ATCACTGCCACCCAGAAGACT-3', ГАФД обратный 5'-CATGCCAGTGAGCTTCCCGTT-3'. Этилметилгидроксипиридина малат был использован в физиологической концентрации равной 70 мкг/мл. Результаты: нами показано, что индоксилсульфат оказывает значительное цитостатическое действие на миобласты in vitro, подавляя их пролиферацию. Этилметилгидроксипиридина малат показал статистически достоверный протективный эффект в отношении миобластов, обработанных указанным токсикантом. В экспериментах по исследованию экспрессии миостатиновой мРНК индоксилсульфат не активировал эту экспрессию, как во временном интервале 48 часов, так и во временном интервале 72 часа. Экспрессия мРНК миостатина, возросла при совместном использовании индоксилсульфата и этилметилгидроксипиридина малата через 48 часов и сохранялась через 72 часа. Выводы: этилметилгидроксипиридина малат, нивелируя токсическое действие индоксилсульфата, оказывает протективное влияние на миобласты in vitro. Механизм совместной активации экспрессии мРНК миостатина индоксилсульфата и этилметилгидроксипиридина малата остается не совсем ясным и требует дальнейшего изучения.

Introduction: indoxyl sulfate is a uremic toxin considered as one of the sources of muscle failure (cachexia) in patients with renal failure; this category of patients has a poor prognosis. Objective: an examination of the possibilities of exogenous regulation of the influence of indoxyl sulfate on myoblasts in vitro. Material and methods: the culture of primary mouse myoblasts was obtained according to the standard method. The cells were cultured in DMEM medium with 10% fetal calf serum (FST) (Gibco) at 37 °C and 6% CO2. The study of the effect of indoxyl sulfate on the proliferation rate of myoblasts was carried out by measuring the rate of reduction of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT, Sigma). To measure the expression of myostatin, RNA was isolated from mouse myoblasts using the Trizol reagent (Thermo Fisher Scientific). Reverse transcription was performed using a set of reagents from Silex. To compare the expression of myostatin mRNA in myoblasts, a real-time polymerase chain reaction was used. Ethylmethylhydroxypyridine malate was used at a physiological concentration of 70 μg/ml. Results: we have shown that indoxyl sulfate has a significant cytostatic effect on myoblasts in vitro, suppressing their proliferation. Ethyl methyl hydroxypyridine malate showed a statistically significant protective effect for myoblasts treated with the toxicant. In experiments where the expression of myostatin mRNA was studied, indoxyl sulfate did activate the expression for euther 48 hours or 72 hours. However, the expression of myostatin mRNA increased with the combined use of indoxyl sulfate and ethylmethylhydroxypyridine malate for 48 hours and persisted after 72 hours. Conclusion: ethylmethylhydroxypyridine malate, leveling the toxic effect of indoxyl sulfate, has a protective effect on myoblasts in vitro. The mechanism of joint activation of mRNA expression of myostatin indoxyl sulfate and ethylmethylhydroxypyridine malate remains unclear and requires further study.

индоксилсульфатхроническая почечная недостаточностьмиостатинэтилметилгидроксипиридина малат (этоксидол)indoxyl sulfatechronic renal failuremyostatinethylmethylhydroxypyridine malate (ethoxydol)ReferencesCheng T-H., Ma M-C., Liao M-T. et al. Indoxyl Sulfate, a Tubular Toxin, Contributes to the Development of Chronic Kidney Disease. Toxins. 2020;12(11):684. https://doi.org/10.3390/toxins12110684Cheng T-H., Ma M-C., Liao M-T. et al. Indoxyl Sulfate, a Tubular Toxin, Contributes to the Development of Chronic Kidney Disease. Toxins. 2020;12(11):684. https://doi.org/10.3390/toxins12110684Смирнов А.В., Голубев Р.В., Коростелева Н.Ю. и др. Снижение физической работоспособности у больных, получающих заместительную почечную терапию: фокус на саркопению. Нефрология. 2017; 21(4):9-29. https://doi.org/10.24884/1561-6274-2017-21-4-9-29.Смирнов А.В., Голубев Р.В., Коростелева Н.Ю. и др. Снижение физической работоспособности у больных, получающих заместительную почечную терапию: фокус на саркопению. Нефрология. 2017; 21(4):9-29. https://doi.org/10.24884/1561-6274-2017-21-4-9-29.Koyun D., Nergizoglu G., Kir K.M. Evaluation of the relationship between muscle mass and serum myostatin levels in chronic hemodialysis patients. Saudi J Kidney Dis Transpl [serial online] 2018. [cited 2020 Dec 12];29:809-15. Available from: https://www.sjkdt.org/text.asp?2018/29/4/809/239648Koyun D., Nergizoglu G., Kir K.M. Evaluation of the relationship between muscle mass and serum myostatin levels in chronic hemodialysis patients. Saudi J Kidney Dis Transpl [serial online] 2018. [cited 2020 Dec 12];29:809-15. Available from: https://www.sjkdt.org/text.asp?2018/29/4/809/239648Milanesi S., Garibaldi S., Saio M. et al. Indoxyl Sulfate Induces Renal Fibroblast Activation through a Targetable Heat Shock Protein 90-Dependent Pathway. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019; Article ID 2050183, 11 pages https://doi.org/10.1155/2019/2050183Milanesi S., Garibaldi S., Saio M. et al. Indoxyl Sulfate Induces Renal Fibroblast Activation through a Targetable Heat Shock Protein 90-Dependent Pathway. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019; Article ID 2050183, 11 pages https://doi.org/10.1155/2019/2050183Kim H.Y., Yoo T., Hwang Y. et al. Indoxyl sulfate (IS)-mediated immune dysfunction provokes endothelial damage in patients with end-stage renal disease (ESRD). Sci Rep. 2017; (7)-3057. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03130-zKim H.Y., Yoo T., Hwang Y. et al. Indoxyl sulfate (IS)-mediated immune dysfunction provokes endothelial damage in patients with end-stage renal disease (ESRD). Sci Rep. 2017; (7)-3057. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03130-zLiew, H., Roberts, M.A., Pope, A. et al. Endothelial glycocalyx damage in kidney disease correlates with uraemic toxins and endothelial dysfunction. BMC Nephrol. 2021;22(1):21. https://doi.org/10.1186/s12882-020-02219-4Liew, H., Roberts, M.A., Pope, A. et al. Endothelial glycocalyx damage in kidney disease correlates with uraemic toxins and endothelial dysfunction. BMC Nephrol. 2021;22(1):21. https://doi.org/10.1186/s12882-020-02219-4Watanabe K., Tominari T., Hirata M. et al. Indoxyl sulfate, a uremic toxin in chronic kidney disease, suppresses both bone formation and bone resorption. FEBS Open Bio; 2017; (7) 1178-1185. doi:10.1002/2211-5463.12258Watanabe K., Tominari T., Hirata M. et al. Indoxyl sulfate, a uremic toxin in chronic kidney disease, suppresses both bone formation and bone resorption. FEBS Open Bio; 2017; (7) 1178-1185. doi:10.1002/2211-5463.12258Adesso S., Magnus T., Cuzzocrea S. et al. Indoxyl Sulfate Affects Glial Function Increasing Oxidative Stress and Neuroinflammation in Chronic Kidney Disease: Interaction between Astrocytes and Microglia. Front. Pharmacol. 2017;8:370. doi: 10.3389/fphar.2017.00370Adesso S., Magnus T., Cuzzocrea S. et al. Indoxyl Sulfate Affects Glial Function Increasing Oxidative Stress and Neuroinflammation in Chronic Kidney Disease: Interaction between Astrocytes and Microglia. Front. Pharmacol. 2017;8:370. doi: 10.3389/fphar.2017.00370Rando T.A., Blau H.M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J Cell Biol. 1994;125(6):1275-87. doi: 10.1083/jcb.125.6.1275Rando T.A., Blau H.M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J Cell Biol. 1994;125(6):1275-87. doi: 10.1083/jcb.125.6.1275Denizot F., Lang R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. J Immunol Methods. 1986; 22;89(2):271-7. doi: 10.1016/0022-1759(86)90368-6Denizot F., Lang R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. J Immunol Methods. 1986; 22;89(2):271-7. doi: 10.1016/0022-1759(86)90368-6Artaza J.N., Bhasin S., Magee T.R. et al. Myostatin inhibits myogenesis and promotes adipogenesis in C3H 10T(1/2) mesenchymal multipotent cells. Endocrinology. 2005; 146: 3547-3557. doi: 10.1210/en.2005-0362Artaza J.N., Bhasin S., Magee T.R. et al. Myostatin inhibits myogenesis and promotes adipogenesis in C3H 10T(1/2) mesenchymal multipotent cells. Endocrinology. 2005; 146: 3547-3557. doi: 10.1210/en.2005-0362Mc Pherron A.C., Lawler A.M., Lee S.J. Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-beta superfamily member. Nature. 1997; 387 (6628): 83-90. DOI:10,1038 / 387083a0Mc Pherron A.C., Lawler A.M., Lee S.J. Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-beta superfamily member. Nature. 1997; 387 (6628): 83-90. DOI:10,1038 / 387083a0Baczek J., Silkiewicz M., Wojszel Z. B. Myostatin as a Biomarker of Muscle Wasting and other Pathologies-State of the Art and Knowledge Gaps. Nutrients. 2020;11;12(8):2401. doi: 10.3390/nu12082401Baczek J., Silkiewicz M., Wojszel Z. B. Myostatin as a Biomarker of Muscle Wasting and other Pathologies-State of the Art and Knowledge Gaps. Nutrients. 2020;11;12(8):2401. doi: 10.3390/nu12082401Watanabe H., Enoki Y., Maruyama T. Sarcopenia in Chronic Kidney Disease: Factors, Mechanisms, and Therapeutic Interventions. Biol Pharm Bull. 2019;42(9):1437-1445. doi: 10.1248/bpb.b19-00513Watanabe H., Enoki Y., Maruyama T. Sarcopenia in Chronic Kidney Disease: Factors, Mechanisms, and Therapeutic Interventions. Biol Pharm Bull. 2019;42(9):1437-1445. doi: 10.1248/bpb.b19-00513Кузярова А.С., Гасанов М.З., Батюшин М.М. и др. Молекулярные основы мышечного истощения: роль миостатина и протеинкиназы β в прогрессировании белково-энергетической недостаточности у пациентов на гемодиализе. Архив внутренней медицины. 2019;9(2):126-132. https://doi.org/10.20514/2226-6704-2019-9-2-126-132Кузярова А.С., Гасанов М.З., Батюшин М.М. и др. Молекулярные основы мышечного истощения: роль миостатина и протеинкиназы β в прогрессировании белково-энергетической недостаточности у пациентов на гемодиализе. Архив внутренней медицины. 2019;9(2):126-132. https://doi.org/10.20514/2226-6704-2019-9-2-126-132Leong S.C., Sirich T.L. Indoxyl Sulfate-Review of Toxicity and Therapeutic Strategies. Toxins. 2016; 8 (358): 1-13. doi:10.3390/toxins8120358Leong S.C., Sirich T.L. Indoxyl Sulfate-Review of Toxicity and Therapeutic Strategies. Toxins. 2016; 8 (358): 1-13. doi:10.3390/toxins8120358Enoki Y., Watanabe H., Arake R. et al. Indoxyl sulfate potentiates skeletal muscle atrophy by inducing the oxidative stress-mediated expression of myostatin and atrogin-1. Sci Reports. 2016; v.6: 32084. DOI:10,1038 / srep32084Enoki Y., Watanabe H., Arake R. et al. Indoxyl sulfate potentiates skeletal muscle atrophy by inducing the oxidative stress-mediated expression of myostatin and atrogin-1. Sci Reports. 2016; v.6: 32084. DOI:10,1038 / srep32084Рагулина В.А. Эндотелиопротективные и кардиопротективные эффекты некоторых производных 3-гидроксипиридина при моделировании эндртоксин-индуцированной модели эндотелиальной дисфункции. Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2016;6(1):70-73. URL: https://www.applied-research.ru/ru/article/view?id=9552Рагулина В.А. Эндотелиопротективные и кардиопротективные эффекты некоторых производных 3-гидроксипиридина при моделировании эндртоксин-индуцированной модели эндотелиальной дисфункции. Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2016;6(1):70-73. URL: https://www.applied-research.ru/ru/article/view?id=9552Колесниченко П.Д., Щеблыкина О.В., Нестерова Н.И. и др., Аддитивное нейропротективное действие производных 3-гидроксипиридина и эритропоэтина человека на модели геморрагического инсульта у крыс. Фармация и фармакология. 2020;8(3):169-180. https://doi.org/10.19163/2307-9266-2020-8-3-169-180Колесниченко П.Д., Щеблыкина О.В., Нестерова Н.И. и др., Аддитивное нейропротективное действие производных 3-гидроксипиридина и эритропоэтина человека на модели геморрагического инсульта у крыс. Фармация и фармакология. 2020;8(3):169-180. https://doi.org/10.19163/2307-9266-2020-8-3-169-180Овсянникова О.А., Карпеева Д.В., Осипенко М.Д. Влияние препарата «Этоксидол» на количество эритробластических островков в условиях воздействия серосодержащего газа на разных этапах постнатального онтогенеза. Кубанский научный медицинский вестник. 2017;1 (162): 99-103.Овсянникова О.А., Карпеева Д.В., Осипенко М.Д. Влияние препарата «Этоксидол» на количество эритробластических островков в условиях воздействия серосодержащего газа на разных этапах постнатального онтогенеза. Кубанский научный медицинский вестник. 2017;1 (162): 99-103.Кукес В.Г., Прокофьев А.Б., Чеча О.А. и др. Влияние антиоксидантов на напряжение кислорода в крови у пациентов с хронической сердечной недостаточностью. Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2016. № 6-1. С. 56-58.Кукес В.Г., Прокофьев А.Б., Чеча О.А. и др. Влияние антиоксидантов на напряжение кислорода в крови у пациентов с хронической сердечной недостаточностью. Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2016. № 6-1. С. 56-58.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.