Изучение цитотоксического действия уремического токсина индоксилсульфата на миобласты in vitro, экспрессию мРНК миостатина в культуре клеток миобластов и возможности экзогенной регуляции

Обоснование: индоксилсульфат - уремический токсин, рассматриваемый как один из источников развития мышечной слабости (кахексии) у пациентов с почечной недостаточностью, ухудшающей прогноз жизни данной категории пациентов. Цель исследования: изучение возможности экзогенной регуляции токсического влияния индоксилсульфата на миобласты in vitro. Материал и методы: культуру первичных миобластов мыши получали по стандартной методике. Клетки культивировали в среде DMEM с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (FST) (Gibco) при 37 °C и 6% CO2. Изучение влияния индоксилсульфата на скорость пролиферации миобластов проводили путём измерения скорости восстановления бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия (МТТ, Sigma). Для измерения экспрессии миостатина РНК из миобластов мыши выделялась с помощью реагента Trizol («Thermo Fisher Scientific»). Обратная транскрипция проводилась с помощью набора реагентов фирмы «Силекс». Для сравнения экспрессии миостатиновой мРНК в миобластах применялся метод полимеразной цепной реакции в реальном времени. Амплификация проводилась в следующем режиме: активация HotTaq-полимеразы - 95 °С, 5 мин; денатурация - 95 °С, 15 с; отжиг и элонгация - 60 °С, 1 мин; 40 циклов. Использовались следующие праймеры: миостатин прямой 5`-CAGCCTGAATCCAACTTAGG-3`, миостатин обратный 5`-TCGCAGTCAAGCCCAAAGTC-3`, ГАФД прямой 5'-ATCACTGCCACCCAGAAGACT-3', ГАФД обратный 5'-CATGCCAGTGAGCTTCCCGTT-3'. Этилметилгидроксипиридина малат был использован в физиологической концентрации равной 70 мкг/мл. Результаты: нами показано, что индоксилсульфат оказывает значительное цитостатическое действие на миобласты in vitro, подавляя их пролиферацию. Этилметилгидроксипиридина малат показал статистически достоверный протективный эффект в отношении миобластов, обработанных указанным токсикантом. В экспериментах по исследованию экспрессии миостатиновой мРНК индоксилсульфат не активировал эту экспрессию, как во временном интервале 48 часов, так и во временном интервале 72 часа. Экспрессия мРНК миостатина, возросла при совместном использовании индоксилсульфата и этилметилгидроксипиридина малата через 48 часов и сохранялась через 72 часа. Выводы: этилметилгидроксипиридина малат, нивелируя токсическое действие индоксилсульфата, оказывает протективное влияние на миобласты in vitro. Механизм совместной активации экспрессии мРНК миостатина индоксилсульфата и этилметилгидроксипиридина малата остается не совсем ясным и требует дальнейшего изучения.

1. Cheng T-H., Ma M-C., Liao M-T. et al. Indoxyl Sulfate, a Tubular Toxin, Contributes to the Development of Chronic Kidney Disease. Toxins. 2020;12(11):684. https://doi.org/10.3390/toxins12110684

2. Смирнов А.В., Голубев Р.В., Коростелева Н.Ю. и др. Снижение физической работоспособности у больных, получающих заместительную почечную терапию: фокус на саркопению. Нефрология. 2017; 21(4):9-29. https://doi.org/10.24884/1561-6274-2017-21-4-9-29.

3. Koyun D., Nergizoglu G., Kir K.M. Evaluation of the relationship between muscle mass and serum myostatin levels in chronic hemodialysis patients. Saudi J Kidney Dis Transpl [serial online] 2018. [cited 2020 Dec 12];29:809-15. Available from: https://www.sjkdt.org/text.asp?2018/29/4/809/239648

4. Milanesi S., Garibaldi S., Saio M. et al. Indoxyl Sulfate Induces Renal Fibroblast Activation through a Targetable Heat Shock Protein 90-Dependent Pathway. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019; Article ID 2050183, 11 pages https://doi.org/10.1155/2019/2050183

5. Kim H.Y., Yoo T., Hwang Y. et al. Indoxyl sulfate (IS)-mediated immune dysfunction provokes endothelial damage in patients with end-stage renal disease (ESRD). Sci Rep. 2017; (7)-3057. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03130-z

6. Liew, H., Roberts, M.A., Pope, A. et al. Endothelial glycocalyx damage in kidney disease correlates with uraemic toxins and endothelial dysfunction. BMC Nephrol. 2021;22(1):21. https://doi.org/10.1186/s12882-020-02219-4

7. Watanabe K., Tominari T., Hirata M. et al. Indoxyl sulfate, a uremic toxin in chronic kidney disease, suppresses both bone formation and bone resorption. FEBS Open Bio; 2017; (7) 1178-1185. doi:10.1002/2211-5463.12258

8. Adesso S., Magnus T., Cuzzocrea S. et al. Indoxyl Sulfate Affects Glial Function Increasing Oxidative Stress and Neuroinflammation in Chronic Kidney Disease: Interaction between Astrocytes and Microglia. Front. Pharmacol. 2017;8:370. doi: 10.3389/fphar.2017.00370

9. Rando T.A., Blau H.M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J Cell Biol. 1994;125(6):1275-87. doi: 10.1083/jcb.125.6.1275

10. Denizot F., Lang R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. J Immunol Methods. 1986; 22;89(2):271-7. doi: 10.1016/0022-1759(86)90368-6

11. Artaza J.N., Bhasin S., Magee T.R. et al. Myostatin inhibits myogenesis and promotes adipogenesis in C3H 10T(1/2) mesenchymal multipotent cells. Endocrinology. 2005; 146: 3547-3557. doi: 10.1210/en.2005-0362

12. Mc Pherron A.C., Lawler A.M., Lee S.J. Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-beta superfamily member. Nature. 1997; 387 (6628): 83-90. DOI:10,1038 / 387083a0

13. Baczek J., Silkiewicz M., Wojszel Z. B. Myostatin as a Biomarker of Muscle Wasting and other Pathologies-State of the Art and Knowledge Gaps. Nutrients. 2020;11;12(8):2401. doi: 10.3390/nu12082401

14. Watanabe H., Enoki Y., Maruyama T. Sarcopenia in Chronic Kidney Disease: Factors, Mechanisms, and Therapeutic Interventions. Biol Pharm Bull. 2019;42(9):1437-1445. doi: 10.1248/bpb.b19-00513

15. Кузярова А.С., Гасанов М.З., Батюшин М.М. и др. Молекулярные основы мышечного истощения: роль миостатина и протеинкиназы β в прогрессировании белково-энергетической недостаточности у пациентов на гемодиализе. Архив внутренней медицины. 2019;9(2):126-132. https://doi.org/10.20514/2226-6704-2019-9-2-126-132

16. Leong S.C., Sirich T.L. Indoxyl Sulfate-Review of Toxicity and Therapeutic Strategies. Toxins. 2016; 8 (358): 1-13. doi:10.3390/toxins8120358

17. Enoki Y., Watanabe H., Arake R. et al. Indoxyl sulfate potentiates skeletal muscle atrophy by inducing the oxidative stress-mediated expression of myostatin and atrogin-1. Sci Reports. 2016; v.6: 32084. DOI:10,1038 / srep32084

18. Рагулина В.А. Эндотелиопротективные и кардиопротективные эффекты некоторых производных 3-гидроксипиридина при моделировании эндртоксин-индуцированной модели эндотелиальной дисфункции. Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2016;6(1):70-73. URL: https://www.applied-research.ru/ru/article/view?id=9552

19. Колесниченко П.Д., Щеблыкина О.В., Нестерова Н.И. и др., Аддитивное нейропротективное действие производных 3-гидроксипиридина и эритропоэтина человека на модели геморрагического инсульта у крыс. Фармация и фармакология. 2020;8(3):169-180. https://doi.org/10.19163/2307-9266-2020-8-3-169-180

20. Овсянникова О.А., Карпеева Д.В., Осипенко М.Д. Влияние препарата «Этоксидол» на количество эритробластических островков в условиях воздействия серосодержащего газа на разных этапах постнатального онтогенеза. Кубанский научный медицинский вестник. 2017;1 (162): 99-103.

21. Кукес В.Г., Прокофьев А.Б., Чеча О.А. и др. Влияние антиоксидантов на напряжение кислорода в крови у пациентов с хронической сердечной недостаточностью. Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2016. № 6-1. С. 56-58.